A型流感H5N1的檢測方法

        今天來看看H5N1禽流感要怎麼檢測,蘇姍仍然以CDC的新聞稿為今天討論的重點,但是今天談論的話題會比較偏科學方面,希望朋友們不會覺得沉悶,當然還是希望有興趣的朋友能夠到CDC的網站上看原文的文獻,很多科學的東西,在翻譯上會略顯困難 ;

http://www.cdc.gov/ncidod/EID/vol11no08/04-1317.htm

 

A型流感H5N1的檢測(Influenza A H5N1 Detection)

Ender K.O. Ng, Peter K.C.Cheng, Antia Y.Y. Ng, T.L. Hoang, and Wilina W.L. Lim

香港衛生局及越南國家衛生與流行病學研究院

 

我們建立了一種靈敏度高且快速即時的反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR))檢測方法來檢驗臨床A型流感H5N1病毒的檢體.這個檢測方法以被H5N1感染的病人檢體來檢測,通過評估並且證實具有較高的靈敏度也可以較快的得到結果.

 

A型流感H5N1病毒引發高治病率首度爆發於1997年的香港,六個人證實因感染而死亡(1).20032月有兩名曾經到過中國福建省的病人在香港的醫院因H5N1感染而被照護(2).2004年初,A型流感H5N1在越南泰國等地爆發並且引起人類的死亡及家禽飼養業的感染(3-5).最近A型流感H5N1的再發生,促使我們正視快速檢測,且要有高靈敏度高正確率的需求.這樣的檢測是重要的,不只在於感染的控制,也在於可以快速的決定感染初期抗病毒藥物的使用.傳統的檢測工具,細胞培養或是血清測試從兩天到兩個星期不等才能得到結果;因此對於治療或感染控制的決策上幫助較不大.另一方面,美國的Becton Dickinson公司或是美國的Binax NOW公司叫做Directigen Flu A+B這種抗原測試是快又簡單,但是對於病毒的亞型(subtype)就沒有辦法了.藉由反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR))可以提供快速且高靈敏度的檢驗,亞型的病毒也是一樣.先前,研究學者用傳統的反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR)) (6-8) 建立了檢測H5N1病毒的方法然後用Southern blot分析法 (6) restriction fragment length polymorphism-based strategy(8)驗證.雖然針對鳥禽的H5基因之即時RT-PCR已經建立起來了,但是這個檢驗方法還沒有在人類臨床上被驗證過.我們建立了一個高靈敏度,快速,精確且即時的RT-PCR檢測方法可以直接檢測人類臨床檢體A型流感的H5亞型(9).當我們用香港及越南病人臨床檢體做為測試檢驗的評估品時,我們發現這個方法比先前用的方法感度更高更快速.(3)

 

研究報告

 

我們的即時RT-PCR是一種多重的的檢測方法,它使用兩組自行設計的primer混合體以及一個標示了兩種螢光發光團的porbe可以同時檢測H5N1HA基因的兩個不同的部位.primerprobe的組合是用美國Applied Biosystems公司的軟體Primer Express software program設計的. primerprobe的設計都是基於最近越南發生H5N1那一株病毒(A/VietNam/1194/2004)的基因序列所建立.對於先前與最近的H5N1病毒株也做了多重比對(multiple alignments)以減少primer設計的錯誤.多重的檢測方法是藉由一致的熔點和最小化cross-hybridization的可能性選擇primersprobes.圖表一顯示了primer以及probe的基因序列.這個檢測方法具有兩個步驟.病毒的RNA用隨機的hexamers反轉錄然後再用PCR放大.簡單來說臨床檢體取140uL用德國Qiagen公司的viral RNA mini kit加到PBS或是viral transport medium, 最後用60uL AVE  buffer沖提. 反轉錄的反應是用4.2uLRNA 2uL 10倍的 PCR buffer(Applied Biosystems), 2.5uM 的隨機hexamer primers(Applied Biosystems), 20單位的 RNase 抑制劑(Applied Biosystems), 1uL(50單位) MuLV  反轉錄酶(Applied Biosystems).

 

反轉錄反應開始於室溫10分鐘,然後42 30分鐘,再來是955分鐘. 用5uL cDNA來作為即時PCR檢測方法中放大用.即時PCR是用一台叫做LightCycler(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)的機器做的.即時PCR反應(總體積20uL)含有2uL LightCycler DNA Master Hybridization Probes reaction mix(Roche Diagnostics GmbH), 3 mmol/L MgCl2, 四個primer各250 nmol/L,以及各125nmol/L的兩種螢光發光團probe. 反應開始於95℃ 10分鐘(preamplification hot start), 然後在95℃ 50個PCR循環 10秒(denaturation),56℃ 15秒鐘(annealing),72℃ 12秒鐘(extension).  在每一個annealing步驟的結束,螢光訊號用LightCycler螢光檢測器測530nm的波長.要小心注意防止PCR的交錯污染(10).

 

為了檢測交錯反應,人類A型流感的 H1, H3, H9亞型, B型流感,及人類 CoV 229E, OC43, 感染呼吸道病毒,感染鼻腔病毒以及腸病毒分離出來的RNA; 然後也以前面提及的即時RT-PCR檢測過.結果顯示這個檢測對於H5的確有專一性. 這個即時檢測方法的靈敏度與其他兩個檢測方法比較,用108/mL的細胞培養被感染量(tissue culture infective dose TCID)50的10分之一來做, 結果顯示這個檢測方法的靈敏度是三者中最高的,並比傳統的nested RT-PCR高出10倍(Table 2). 我們分析了香港1997年13個確定是H5N1病人發病10天內的18個檢體,以及10個2003年不確定採樣發病天數的檢體,也分析了五個2004年越南確定是被H5N1感染的病人的檢體.所有的檢體都藉由病毒分離與定性確定為H5N1感染.我們的結果證明RT-PCR的檢測率為100%(28 of 28 samples), nested RT-PCR為89%(25 of 28 samples).這項結果表示即時檢測法擁有相近於甚至更好於nested RT-PCR檢測法的靈敏度.  Viral load分析顯示在這些檢體中H5N1 RNA的濃度範圍在101到106 TCID50/mL.藉由兩個病患連續的檢體分析顯示病患1的viral load從第零天到第三天增加了五倍,病患2的viral load從第四天到第七天降低了三倍(Figure).因為可以分析的檢體數有限,無法測定出viral load的高峰期.有研究報告顯示受H5N1感染的病人鼻咽吐氣的viral load低於2003年這些受H3N2感染病人的鼻咽吐氣vital load(11).為了決定1997和2004的H5N1病人與H3N2病人是不一樣,這兩群病人的檢體用可定量的即時RT-PCR來檢測.相同的,viral load也由一條標準線來定量.平均來說22個H3N2病人的viral load是1.5×106 TCID50/mL,然而在1997或2004的H5N1病人的viral load平均是1.6X105 TCID50/mL.因此,1997和2004 H5N1病人的viral load幾乎低了十倍(12).這個結果跟先前提到的結果是一致的.

 

結論

 

在這份研究報告中,我們強調我們這種新的多重且即時RT-PCR檢測法對於兩地區的H5基因比nested RT-PCR方法來的靈敏度高甚至比單一primer和probe的即時RT-PCR也來的靈敏.我們的數據證明了這個方法對H5亞型的專一性並且不同時間爆發(1997, 2004, 2004)的病人檢體之H5 RNA 都可以檢測的到並且定量出來.不像nested RT-PCR,即時RT-PCR檢測法不但降低感染的風險,也降低了檢測時間到1-2小時,比nested RT-PCR快了三倍的時間.結論就是,我們的研究強調的是我們的即時RT-PCR檢驗法很快,具有專一性,並且直接對A型流感的H5亞型具有相當的靈敏度,或許可以成為一般例行檢測的方法.

 

黃博士(Ender K.O. Ng)是香港衛生局衛生保健中心病毒組的研究員.他的研究著重在人類病原體的分子檢測,尤其是由病毒感染的案例.

 

參考文獻

  1. Saw TA, Lim W, Shortridge K, Tam J, Liu KK, Mak KH, et al. Isolation of avian influenza A(H5N1) viruses from humans—Hong Kong, May–December 1997. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 1997;46:1204–7.
  2. World Health Organization. Influenza A (H5N1), Hong Kong Special Administrative Region of China. Wkly Epidemiol Rec. 2003;78:49–56.
  3. Tran TH, Nguyen T, Nguyen TD, Loung TH, Pham PM, Nguyen VC, et al. Avian influenza A (H5N1) in 10 patients in Vietnam. N Engl J Med. 2004;350:1179–88.
  4. Chotpitayasunondh T, Lochindarat S, Srisan P, Chokepaibulkit K, Weerakul J, Maneeratanaporn M, et al. Cases of influenza A (H5N1)—Thailand, 2004. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2004;53:100–3.
  5. Viseshakul N, Thanawongnuwech R, Amonsin A, Suradhat S, Payungporn S, Keawchareon J, et al. The genome sequence analysis of H5N1 avian influenza A virus isolated from the outbreak among poultry populations in Thailand. Virology. 2004;328:169–76.
  6. Yuen KY, Chan PK, Peiris M, Tsang DN, Que TL, Shortridge KF, et al. Clinical features and rapid viral diagnosis of human disease associated with avian influenza A H5N1 virus. Lancet. 1998;351:467–71.
  7. Munch M, Nielsen LP, Handberg KJ, Jorgensen PH. Detection and subtyping (H5 and H7) of avian type A influenza virus by reverse transcription-PCR and PCR ELISA. Arch Virol. 2001;146:87–97.
  8. Cooper LA, Subbarao K. A simple restriction fragment length polymorphism-based strategy that can distinguish the internal genes of human H1N1, H3N2, and H5N1 influenza A viruses. J Clin Microbiol. 2000;38:2579–83.
  9. Spackman E, Senne DA, Myers TJ, Bulaga LL, Garber LP, Perdue ML, et al. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes. J Clin Microbiol. 2002;40:3256–60.
  10. Kwok S, Higuchi R. Avoiding false positives with PCR. Nature. 1989;339:237–8.
  11. Peiris JS, Yu WC, Leung CW, Cheung CY, Ng WF, Nicholls JM, et al. Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease. Lancet. 2004;363:617–9.
  12. Ward CL, Dempsey MH, Ring CJ, Kempson RE, Zhang L, Gor D, et al. Design and performance testing of quantitative real time PCR assays for influenza A and B viral load measurement. J Clin Virol. 2004;29:179–88. 

另外在新型流感資訊網上也有一鍋資料可以參考

http://203.65.72.83/avnflu/流感H5sop.pdf

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